Esperimentu elettroforesi di l'emoglobina

Principiu di l'esperimentu

L'elettroforesi di l'emoglobina hà per scopu di detectà è cunfirmà diverse hemoglobine normali è anormali.

A causa di e diverse carichi è punti isoelectric di diversi tipi di hemoglobina, in una certa suluzione di tampone di pH, quandu u puntu isoelectric di l'emoglobina hè più bassu di u pH di a suluzione tampone, l'emoglobina porta una carica negativa è migra versu l'anodu durante l'elettroforesi. À u cuntrariu, l'emoglobina cù una carica positiva si move versu u cathode.

Sottu una certa tensione è dopu à un tempu specificu di l'elettroforesi, l'emoglobine cù carichi è pesi molecolari diffirenti mostranu direzzione è velocità di migrazione diverse. Questu permette a siparazione di zoni distinti, è l'analisi di scansione colorimetrica o elettroforetica successiva pò esse realizatu nantu à queste zoni per quantificà diverse hemoglobine. U metudu più cumunimenti utilizatu hè l'elettroforesi di membrana d'acetate di cellulosa à pH 8.6.

Dentru u citoplasma, i gruppi di etilenglicol (CHOH-CHOH) prisenti in sustanzi di glicogenu o polisaccaridi (cum'è mucopolisaccaridi, mucoproteini, glicoproteini, glicolipidi, etc.) sò ossidati da l'acidu periodicu è cunvertiti in gruppi di aldeide (CHO-CHO). Questi gruppi di aldeide si combinanu cù u reattivu Schiff incolore-rossu violaceu, furmendu un tintu rossu-viola chì si deposita induve i polisaccaridi sò prisenti in a cellula. Sta reazione hè cunnisciuta cum'è colorazione periodica di l'acidu-Schiff (PAS), prima chjamata colorazione di glycogen.

Metudu di esperimentu

Materiali:Acetate di cellulosemembrane, apparatu di elettroforesi(DYCP-38C è alimentazione DYY-6C), Strumentu di carica di mostra superiore (pipetta), spettrofotometru, cuvette colorimetriche, buffers.

Buffer:

(1) pH 8,6 TEB Buffer: Pesa 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g àcitu boricu, è aghjunghje acqua distillata à 1000 ml.

(2) Borate Buffer: Pesa 6,87 g borax è 5,56 g àcitu boricu, è aghjunghje l'acqua distillata à 1000 ml.

Prucedura:

Priparazione di a suluzione di l'emoglobina

Pigliate 3 ml di sangue chì cuntene heparin o citrate di sodium cum'è anticoagulante. Centrifugare à 2000 rpm per 10 minuti è scartà u plasma. Lavate i globuli rossi trè volte cù salina fisiologica (750 rpm, 5 minuti di centrifugazione ogni volta). Centrifugare à 2200 rpm per 10 minuti è scartà u supernatant. Aghjunghjite una quantità ugguali di acqua distillata, dopu aghjunghje 0,5 volte u voluminu di tetrachloru di carbonu. Agite vigorosamente per 5 minuti, è poi centrifuge à 2200 rpm per 10 minuti per cullà a suluzione Hb superiore per l'usu dopu.

Soaking the Membrane

Tagliate a membrana acetate di cellulosa in strisce di 3 cm × 8 cm. Immergete in tampone pH 8,6 TEB finu à saturazione cumpleta, poi sguassate è asciugate cù carta di filtru.

Spotting

Aduprà una pipetta per spot 10 μl di a suluzione di l'emoglobina verticalmente nantu à a membrana di acetate di cellulosa (u latu russu), à circa 1,5 cm da u bordu.

Elettroforesi

Pour a suluzione buffer borate in a camera di elettroforesi. Pone a membrana d'acetate di cellulosa cù u latu spotted à l'estremità cathode di a camera. Eseguite à 200 V per 30 minuti.

Eluzione

Cut out the HbA and HbA2 zones, put them in test tubes separati, è aghjunghje 15 ml è 3 ml d'acqua distillata, rispettivamente. Agite delicatamente per l'eluzione di l'emoglobina cumpletamente, dopu mischjà.

Colorimetria

Zero l'assorbanza cù acqua distillata per a suluzione di eluzione è misura l'assorbanza à 415 nm.

U calculu

HbA2 (%) = Assorbanza di tubu HbA2 / (Assorbanza di tubu HbA × 5 + Assorbanza di tubu HbA2) × 100%

Calculu di i risultati sperimentali

Gamma di Riferimentu per pH 8,6 TEB Tampone Elettroforesi Acetate di Cellulosa: HbA > 95%, HbA2 1% -3,1%

Notes

U tempu di l'elettroforesi ùn deve esse troppu longu. A membrana acetate di cellulosa ùn deve micca secca durante l'elettroforesi. Ferma l'elettroforesi quandu HbA è HbA2 sò chjaramente separati. L'elettroforesi prolongata pò causà diffusione di banda è sfocatura.

Evite aduprà troppu campionu. L'eccessivu di liquidu di l'emoglobina pò purtà à un distaccu di a banda o una tintura insufficiente, risultatu in livelli falsi di HbA elevati.

Impedisce a contaminazione di a membrana di l'acetate di cellulosa cù proteine.

U currente ùn deve esse troppu altu; altrimenti, i bandi di l'emoglobina ùn ponu micca separati.

Includite sempre specimens da individui normali è hemoglobini anormali cunnisciuti necessarii cum'è cuntrolli.

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