Tecniche basiche di elettroforesi su gel d'agarosio (2)

Preparazione di campioni èCarica

A causa di l'usu di un sistema buffer continuu senza stacking gel in a maiò parte di i casi, i campioni duveranu avè una cuncentrazione approprita è un picculu voluminu. Aduprà apipettaper aghjunghje lentamente a mostra, cù 5-10 μg per pozzu, per evità una diminuzione significativa di a risoluzione. Quanducarica di mostra, l'alimentazione elettrica deve esse disattivata. U campionu deve cuntene un tintura indicatore (0,025% bromophenol blu o aranciu) è saccharose (10-15%) o glycerol (5-10%) per aumentà a so densità, cuncentrazione di a mostra, è impedisce a diffusione. In ogni casu, qualchì volta saccarosi o glycerol pò causà bande in forma di U in i risultati di l'elettroforesi, chì ponu esse evitati usendu 2,5% Ficoll (polyvinylpyrrolidone).

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Elettroforesi

A tensione per l'elettroforesi hè 5-15 V / cm, in generale circa 10 V / cm. Per a separazione di grande molécule, u voltage deve esse più bassu, di solitu micca più di 5 V / cm.

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Tintura

U bromuro di etidio di colorante fluorescente (EB) hè comunmente utilizatu per a tintura per osservà bande di DNA in gel di agarose. EB pò inserisce trà e coppie di basi di molécule di DNA, facendu chì EB si ligà cù DNA. L'assorbimentu di a luce ultravioletta di 260 nm da l'ADN hè trasferitu à EB, è l'EB legatu emette fluorescenza à 590 nm in a regione rossu-aranciu di u spettru di luce visibile. Staining the gel in a 1 mmol / L MgSO4 solution for 1 hour pò riduce a fluorescenza di fondo causata da unbound EB, facilitendu a deteczione di picculi quantità di DNA.

A tintura EB hà parechji vantaghji: hè faciule d'utilizà, ùn rompe micca l'acidi nucleici, hà una sensibilità alta, è ponu tinte l'ADN è l'RNA. EB pò esse aghjuntu à a mostra è seguitu cù l'absorzione UV in ogni mumentu. Dopu a tintura, l'EB pò esse eliminatu da l'estrazione cù n-butanol.

In ogni casu, u tintu EB hè un mutagenu potente, è e precauzioni, cum'è l'usu di guanti di polietilene, deve esse pigliatu durante a manipulazione. L'aranciu di l'acridina hè ancu un tintu cumunimenti utilizatu perchè pò diferenze trà l'acidi nucleici monofilari è doppiu filamenti (DNA, RNA). Presenta una fluorescenza verde (530 nm) per l'acidi nucleici a doppia fila è una fluorescenza rossa (640 nm) per l'acidi nucleici monofilare. Inoltre, altri tinti cum'è u blu di metilenu, u verde di metilenu è a quinolina B ponu esse aduprati per a tintura.

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Tempu di post: Dec-20-2023